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Science亮点 | 活细胞中实时观察基因编辑时间:2019-09-12

基因编辑是指在活体基因组中进行DNA插入,删除或者突变的一项技术,它还有可能导致染色体重排,易位或者替换【1,2】。测序技术可以识别和检测这些变化,但是,却做不到实时动态监控。传统的荧光原位杂交技术(Fluorescent in situ hybridization,简称FISH)需要样本DNA发生变性,而荧光标记的cas9技术的样本则需要固定【3,4】。随着基因组研究的逐渐深入,学界亟需一种可以在活细胞中实时动态观测基因变化的技术。


2019年9月6日,来自斯坦福大学的Lei S. Qi团队在Science杂志上发表了题为 CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription 的文章,报道了一种命名为“CRISPR活细胞荧光原位杂交技术(CRISPR LiveFISH)”的活细胞成像新技术。这种技术实现了在活细胞中实时观测单个细胞的基因组DNA和RNA片段,进而实时追踪基因组编辑、转录、重排和功能变化。



如下图所示,作者首先将等量的dCas9-EGFP融合蛋白和荧光标签Cy3标记的先导RNA(gRNA)合称为荧光-核酸-蛋白复合物(Fluorescent-ribonucleoproteins,简称fRNP),这个复合物特异针对3号染色体上一段重复序列。接着,作者将其转入人类骨髓瘤细胞系U2OS。流式细胞术检测发现,转入4小时后,95%的gRNA荧光信号发生淬灭,但是,在3号染色体上,却发现了稳定且高强度的荧光信号,这表明,染色体上已经形成了稳定的dCas9-gRNA复合体。基于上述实验,作者构建了CRISPR LiveFISH技术。并将这一技术加以推广应用。

 

 

首先,应用CRISPR LiveFISH技术,可以在活细胞水平识别和定义染色体疾病。小儿帕套综合征(Patau syndrome),又称为13-三体综合征,患者具有3个13号染色体,从而导致严重的器官病变,体力智力低下,最终致命。作者设计fRNP特异针对13号染色体的重复序列,从而在患者单个活细胞中观察到3个重复的荧光信号,也就是3个13号染色体。


其次,应用CRISPR LiveFISH技术,可以实时观测DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)。作者在U2OS细胞系中稳定表达带有DNA双链断裂感应子Apple的53BP1融合蛋白(即构建U2OS-53BP1-Apple 细胞系),然后共转入导致3号染色体PPP1R2位点双链断裂的基因编辑RNP(Cas9/gPPP1R2)和标记荧光信号的fRNPs。作者发现,基因组双链断裂处招募了大量53BP1蛋白,并且,这一高速且动态的过程持续了数小时之久。与此同时,作者还观察到诸多基因编辑细节。比如,53BP1蛋白的招募以及随后解离,表示此处双链断裂已然修复完毕。再比如同一位点53BP1反复招募解离,表示此处进行着活跃且反复的基因修复。还比如不同位点处于同一53BP1募集区(foci),则标志着发生同源重组。


再次,应用CRISPR LiveFISH技术,可以实时观测染色体易位。作者在上述细胞体系中同时转入两组基因编辑RNP,分别针对3号染色体的gPPP1R2位点和13号染色体的SPACA7位点。作者发现,这两个位点的基因活动极为相似,并且,这两组染色体从最初的保持一定距离,到缓慢的靠近,最终长时间相连,很可能是发生了染色体易位。随后,作者通过分子克隆技术,证实了此处的确发生了染色体易位。


最后,应用CRISPR LiveFISH技术,可以同时实时观测RNA和DNA。作者采用U2OS 2-6-3细胞系,此细胞系中含有一段LacO重复序列,并且,其下游连有多西环素(Doxycycline,简称Dox)诱导的MS2序列读码框架。作者同时转入针对LacO DNA的Cas9 gRNA和针对MS2 RNA的Cas13 gRNA【5,6】,发现,在Dox诱导下,DNA和RNA都被成功标记,并且,MS2逐渐聚集在LacO区域。


这篇文章是方法学研究的精品。作者综合了活细胞显微术,荧光原位杂交术和CRISPR基因编辑技术,创建了CRISPR活细胞荧光原位杂交技术(CRISPR LiveFISH)。这一技术可以实时检测单细胞中的DNA双链断裂,染色体易位,DNA-RNA相互作用等活细胞基因变化,并且,可以识别和定义染色体疾病。这一技术的亮点有两处,一是可以直接应用于活细胞,从而发现基因组活动的动态细节。二是通过与其它分子生物学手段的联合应用,相辅相成,可以更加高效深入的研究基因组的活动变化。


原文链接:https://science.sciencemag.org/content/early/2019/09/04/science.aax7852

  

(本文转自自BioArt)

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